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常见问题
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  • Westernblot 结果中背景较高

    可能的原因及建议: 

    ●膜封闭不够延长封闭的时间;选择更加适合的封闭液。 

    ●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度。 

    ●一抗孵育的温度偏高,建议 4℃结合过夜。 

    ●选择的膜容易产生高背景,一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF 膜低。 

    ●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。 

    ●检测时曝光时间过长,减少曝光时间。

  • 为什么提高大分子量蛋白的转移的时候,小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?

    小分子的蛋白在转移过程中,会透过膜去,所以大分子的上去以后,有一部分小分子的就透过去 了。

  • 请问一下 PVDF 膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?

    一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几次后,蛋白容易掉 下来,结果较差。PVDF 膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合,同时也有疏水作用,但相对较弱。这 样的话,PVDF 膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。

  • 怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道都能很直,上样的量和灌胶是否很重要,电压有什么要求?

    影响跑胶跑的质量,有以下几个因素: 

    (1)电压,小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶 55v,分离胶75v 就能跑得很好。 

    (2)胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶.

  • 封闭,一抗,二抗时的温度有没有什么规定呢,比如在室温里做,或者要在4 度下?

    均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后4 度过夜。

  • 转膜后的脱脂奶粉封闭液是 5%的TBST 脱脂奶粉”,其中TBST 最后那个 T 是 Tween 吗,浓度 多大?

    是 Tween,配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),NaCl:8g,Trisbase:2.42g加水 800ml 溶解,加500-1000ul 的Tween-20,用HCl 调节 pH至7.4,加水定容至1L。

  • 做半定量WesternBlot,内参 β-actin,GAPDH 哪个好?

    选用beta-actin 就可以。

  • 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区 别吗?

    一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊 的方法,一般来说都没有区别。

  • 核内抗原WesternBlot 内参选择什么合适?

    可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的,有很多都可以当成内参,在网上 查查就可以选出你要的内参。

  • 我用的是可视 marker,但是电泳总跑不全 8 条带,请问什么原因?怎样改善?胶用过 8%,10%,12%,都是这样。marker 是新买的。

    一般来说,是小分子量Marker 跑走了,增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错 的选择。

  • 是否 WesternBlot 实验半定量一定要加ACTIN 内参?

    对于发表文章的实验最好加内参,实验严谨。

  • 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上,转移效率低怎么样解决?

    可以考虑:转移缓冲液中加入 20%甲醇(是指终浓度),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可 增加蛋白质和NC 膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转 移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用 小孔径的NC 膜(0.2 微米)。

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