一、E.coli/phage裂解液预吸附血清

1.将 E.coli /phage lysate 以 1:10-20 稀释在 TBST 溶液中。

2.将 4 张 82mm 的 nitrocellulose membranes（NC）浸入稀释后的 E.coli/ phagelysate 中，室温下水平摇动 30 分钟，取出 NC 并使膜沥干。

3.用 50ml TBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 分钟。

4.用滤纸轻轻吸去膜上的液体。

5.将膜放入 50ml 封闭液中，室温下水平摇动最少 30 分钟。

6.将膜从封闭液中取出，用 50ml TBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 分钟。

7.将血清按 1:5 稀释在 TBST 溶液中，将一张膜放入溶液中，37℃下轻轻水平摇动 10 分钟。

8.从血清稀释液中取出膜并丢弃,加入另外一张新膜,37℃下轻水平摇 10 分钟.

9.重复步骤 8，直至所有 4 张膜都处理完。

10. 除去最后一张膜，收集血清（primary antibody），分装成小份储存于-80℃冰箱中待用。

注意：

该步处理过程是为了去除血清中能与细菌和噬菌体裂解蛋白进行免疫反应的抗体，这样可以减少假阳性率；

一抗不能反复冻融，化冻后不要再次冰冻，可放于 4℃作短暂保存。可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，则需要至少 10个病人血清进行混合；

二、噬菌体筛选

1.准备 NZY agar plates（至少用前 24 小时倒好），用前在 37℃培养箱中烘烤1-2 小时以去除水滴。

2.将过夜培养的 XL1-blue MRF’细菌 2000 转/分，离心 10 分钟，将细菌溶解在10mM MgSO4 中，调整细菌浓度为 OD600=0.5。

3.融化 NZY top，并将 NZY top 放在 50℃水浴中。

4.将适量的 XL1-blue MRF’细菌溶液与一定稀释度的 phage 文库混合，37℃下共同作用 15 分钟。直径 90mm 平板：200?l XL1-blue 细菌+适量的 phage 文库直径 150mm 平板：600?l XL1-blue 细菌+适量的 phag 文库（噬菌斑数量一般保持在 3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm）

5.将步骤 4 中的混合液与 NZY top 溶液混合（200?l 混合液+3-4mlNZY top 溶液；600?l 混合液+8-10 ml NZY top 溶液），倒入到 NZY agar plates 中，室温下放 10 分钟左右，然后倒置放于 37℃下培养。

6.当噬菌斑刚好可看到时（大约 5-8 小 时 ），从培养箱中拿出平板。

7.将 NC 放入 10mM IPTG 溶液中完全浸湿，在空中使膜沥干，并做好 3 个不对称的标记。

8.将 IPTG 处理好的 NC 贴在平板上，不留气泡，然后倒置放于 37℃下培 养 。

9.过夜培养后，第二天早上取出平板，用镊子将膜轻轻掀起，注意不要将培养基粘在膜上。

10. 将膜放于 50ml TBST 溶液中，水平脱色摇床上震荡洗膜 3 次，每次 10 分钟。

11. 将膜放入 50ml 封闭液中，水平摇动，封闭 4-6 小时。

12. 在封闭液中加入适当滴度的一抗，水平摇动处理过夜。

13. 将膜放于 50ml TBST 溶液中，洗膜 3 次，每次 10 分钟。

14. 在封闭液中加入适当滴度的二抗（各个公司的二抗使用滴度不同），室温水平摇动 1-2 小时。

15. 将膜放于 50ml TBST 溶液中，洗膜 3 次，每次 10 分钟，最后用 50ml TBS溶液洗膜 15-20 分钟，取出膜空气中沥干。

16. 将膜放入 BCIP-NBT 显色液中避光显色，水平摇动直到阳性斑点可见为止。

17. 从显色液中取出膜放在 TBS 溶液中，空气中使膜干燥。

18. 根据所做的标记,将膜与平板对齐,将平板上对应的阳性克隆区域的培养基挖出放入 500?l SM buffer 中,并加入 25 ml chloroform,4℃贮存（最多可贮 6 月）。

19. 第一轮筛选得到阳性克隆需要进行第二轮筛选以去除假阳性并获得阳性单克隆噬菌体。过程如第一轮筛选，只不过用直径 90mm 平板；具体过程见步骤 4，这时所加入的噬菌体溶液是第一轮筛选得到的噬菌体上清（见步骤 18），在用前要滴定好噬菌体的滴度，噬菌斑的数量以可区分出单个克隆，同时密度不能太稀为标准（一般 100-200 pfu/90mm）。20. 按第一轮相似的过程进行实验，最后显色，确定真正的阳性克隆，并将阳性单克隆所在的培养基挖出放入 500?l SM buffer 中，并加入 25 ml chloroform，4℃贮存（最多可贮存 6 月 ）。

注意：

封闭液一般可用：5%的脱脂牛奶或 1%的 BSA 溶解在 TBST 溶液中。第一轮筛选用 150mm 的平板；第二轮筛选用 90mm 的平板，一般需要筛选至少 1 x 106 pfu。认真做好三个不对称的标记，特别在第二轮挑选阳性克隆时要仔细将膜与平板吻合好，不能挑错。

三、单克隆剪切

1.取第二轮筛选得到的阳性克隆贮存液上清。

2.将过夜培养的 XL1-blue MRF’细菌 2000 转/分离心 10 分钟，将细菌溶解在10mM MgSO4 中，调整细菌溶度到 OD600=1.0。

3.在一个 EP 管中加入：200?l XL1-blue MRF’细菌+250ul phage stock（步骤 1）+1 ul ExAssist helper phage。

4.将以上三种样品混合，37℃下共同保温 15 分钟。

5.将样品混合物加入到 3 ml LB 培养基中，37℃震荡培养 3-4 小时。

6.将试管放于 65-70℃水浴 20 分钟，3000 转/分，离心 15 分钟。

7.将上清转入新的离心管中，已发生剪切的 phage particles 在上清中（上清可在 4℃下储存 1-2 月 ）。

8.将 100ul phage 上清+200ul SOLR cells（OD600=1.0）混合，37℃保温 15 分钟 。

9.取步骤 8 中溶液 5-10 ul 涂于 LB-amp agar plates（amp=50ug/ml），过夜培养 。

10. 第二天细菌长出，随机挑取单克隆接种到 LB-amp 培养基中培养过夜。

11. 过夜培养细菌分为三部分：（1）提取质粒做双酶切，鉴定外源基因的大小；（2）送样品进行 DNA 测序（3）加入 30-40%的甘油进行保种，分装成小份储存于-80℃备用。

附录:

1SMbuffer(1L):

(5.8 g NaCl+2.0 g magnesium sulfate+50 ml 1M Tris (pH=7,5)+0.1 g gelatin)

2、AP-buffer:

(100 mM Tris HCI (pH 9.5) ;

100 mM NaCl ;

5 mM MgCl2)

3、10xTBS（1L）：

（0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)；1.5 M NaCl）

4、LBBroth（1L）：

（10 g NaCl+10 g of tryptone+5 g of yeast extract）